L'ADN : DÉCHIFFRER POUR MIEUX COMPRENDRE LE VIVANT
Mutations et réparation de l'ADN


La molécule d'ADN subit en permanence des attaques physiques, chimiques ou biologiques. Plusieurs systèmes de réparation veillent sur l'intégrité du patrimoine génétique.

Publié le 25 janvier 2018


LES DIFFÉRENTS TYPES DE MUTATIONS,
LES AGENTS MUTAGÈNES
Les mutations génétiques
Au moment de la division, la cellule déclenche le processus de réplication de l’ADN pour en obtenir une copie. De temps en temps, le système produit quelques erreurs : ce sont les mutations. Le plus souvent, elles sont sans conséquence, puisqu’il y a 98 % de chances qu’elles tombent dans une partie du génome qui ne code pas pour la synthèse d’une protéine (ADN non-codant).
D’autres mutations, en revanche, peuvent modifier la composition ou la quantité d’une protéine et être à l’origine d’une maladie génétique. Parmi les différents types de mutations, certaines sont ponctuelles avec perte, addition, ou substitution d’une seule base. Mais elles peuvent aussi concerner des zones plus larges et occasionner de plus grandes perturbations.

Les agents mutagènes


D’autres sources, environnementales ou liées aux activités de l’Homme, peuvent également modifier l’ADN. Les facteurs mutagènes sont biologiques, physiques ou chimiques. La Nature s’est dotée d’agents particulièrement efficaces, les virus, dont certains peuvent tuer. Les rayons UV, X et la radioactivité sont des agents physiques à la méthode radicale : ils cassent la molécule d’ADN. Quant aux agents mutagènes chimiques, ils sont légions ; par exemple : le benzopyrène, présent dans la fumée de cigarette, le trichloréthylène, utilisé comme solvant dans les pressings...

Stress cellulaire et réponse aux agressions
Autonome, la cellule n'en dépend pas moins de son environnement, des cellules qui l'entourent et du milieu dans lequel elle vit. À chaque minute, elle défend son équilibre et son intégrité. Elle fait face aux situations de stress grâce à des voies de signalisation qui lui permettent d'identifier son agresseur et de vérifier l'intégrité de son système. Selon l'importance des dommages, elle décide alors de se réparer ou de se donner la mort.

Les signaux d'alerte
Par quoi une cellule peut-elle être stressée ? Une infection virale ou bactérienne, des produits toxiques, des rayonnements (UV, ionisants, rayons X…), des mutations génétiques, le manque d'eau ou de nutriments… La cellule contrôle un très grand nombre d'informations qu'elle reçoit de son environnement et de son propre système. Sa survie dépend de sa capacité à s'informer de façon continue. Quand les signaux témoignent d'un problème, par exemple des cassures double-brin dues à des rayonnements ionisants, un système d'alerte se déclenche. Les voies de signalisation sont nombreuses, complexes et encore peu connues.

La réparation de l'ADN
Lorsque la cellule a évalué les dégâts comme modérés, une voie de réparation, spécifique pour chaque type de dommage, est activée. Dans le cas de cassures double-brin par exemple, des protéines se chargent de la réparation. Mais cela peut parfois générer des mutations et mener jusqu'à une instabilité génétique et au développement d'un cancer. Pour étudier ces mécanismes de réparation, il existe un modèle tout à fait intéressant : la bactérie Deinococcus deserti.
Elle tolère des doses très élevées de radiations gamma et UV et de longues périodes de déshydratation extrême. Cette extrême tolérance est liée à la réparation très efficace de dommages massifs de l'ADN, notamment des cassures double-brin qui sont létales chez la plupart des organismes. Un ensemble de processus, à la fois actifs (réparation efficace de l'ADN) et passifs (super-compaction de l'ADN, protection des protéines contre l'oxydation) contribuent à sa radio-tolérance.

La mort programmée
Une cellule se sacrifie pour l'organe et l'organisme. En cas de réparation difficile ou impossible, elle déclenche son apoptose. Cette mort cellulaire, contrairement à la nécrose, est programmée. Elle se déroule suivant un enchaînement de phénomènes complexes : la chromatine se condense et la cellule se fragmente en corps dits apoptotiques qui sont ensuite détruits. Les étapes de déclenchement sont contrôlées par 3 gènes et les différentes phases de la destruction cellulaire seraient contrôlées par une dizaine d'autres. Que se passe-t-il en cas de dysfonctionnement de ce processus ? L'équilibre entre croissance et mort cellulaire est rompu, l'intégrité de l'organisme n'est plus assurée. Dans le cas d'une prolifération des cellules néfastes, l'organisme peut développer un cancer. La stimulation de l'apoptose, quant à elle, peut conduire l'organisme à se retourner contre lui-même. C'est le cas pour le Sida qui affaiblit par pyroptose accrue des lymphocytes TCD4, diminue les défenses immunitaires de l'organisme et prépare un terrain favorable à des maladies opportunistes.

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LE DIALOGUE MOLÉCULAIRE DES SYMBIOSES

L'azote est l'un des constituants des molécules organiques. Il constitue, sous la forme d'azote moléculaire N2, environ 80% de l'atmosphère terrestre. Cependant, il représente un facteur limitant majeur de la croissance des végétaux cultivés car ceux-ci ne peuvent l'utiliser que sous des formes non gazeuses, ammoniac ou nitrates. Seules les bactéries dites fixatrices d'azote peuvent utiliser l'azote gazeux N2 et le transformer en ammoniac. Comme cette réaction est très coûteuse en énergie, certaines se sont associées en symbiose avec des organismes photosynthétiques capables de transformer l'énergie lumineuse en énergie chimique. L'homme utilise ces associations ou symbioses en agriculture : - la symbiose entre des cyanobactéries et des fougères aquatiques est utilisée comme ""engrais vert"" dans les rizières asiatiques - la symbiose entre les bactéries du sol rhizobium avec les légumineuses (pois, trèfle, soja) permet de diminuer l'apport d'engrais azotés de type nitrates dans les pays occidentaux. Les mécanismes intimes des interactions entre les deux partenaires de la symbiose rhizobium-légumineuses sont étudiés par les scientifiques. Ils espèrent pouvoir créer une symbiose entre les rhizobium et les céréales. L'apport d'engrais azotés et la pollution conséquente s'en trouveraient d'autant diminués.

Texte de la 8ème conférence de l'Université de tous les savoirs réalisée le 8 janvier 2000 par Jean Dénarié
Dialogue moléculaire des symbioses
Alors que l’azote moléculaire (N2) constitue environ 80% de l’atmosphère terrestre, l’azote constitue un facteur limitant majeur de la croissance des végétaux cultivés. Ce paradoxe est dû au fait que la molécule d’azote est très stable et que les organismes supérieurs (eucaryotes) sont incapables de l’utiliser. Seules des bactéries (procaryotes) dites fixatrices d’azote sont capables de réduire N2 en ammoniac. La réduction de l’azote est très exigeante en énergie : il faut 16 molécules d’ATP (donneur d’énergie dans les cellules) pour réduire une molécule d’azote. C’est pourquoi les systèmes fixateurs d’azote les plus efficaces sont des symbioses associant des bactéries fixatrices à des organismes photosynthétiques capables de transformer l’énergie lumineuse en énergie chimique. Trois symbioses jouent un rôle particulièrement important.
(i) En Asie l’association de cyanobactéries avec des fougères aquatiques, les Azolla, est exploitée pour servir d’engrais vert dans les rizières.
(ii) Des plantes ligneuses appartenant à plusieurs familles forment des nodosités fixatrices d’azote avec des bactéries filamenteuses (actinomycètes) du genre Frankia. Ces plantes, dites à actinorhizes, jouent un rôle important dans la colonisation de terres peu fertiles ou dégradées (Dommergues et al. 1999).
(iii) Mais la symbiose la plus importante d’un point de vue écologique et agronomique est celle associant des bactéries du sol, les Rhizobium, aux légumineuses.
De nombreuses légumineuses ont une grande importance dans l’alimentation humaine et animale grâce à leur richesse en protéines. Des plantes comme le soja, l’arachide, le pois, les haricots sont cultivées pour la production de graines, tandis que la luzerne et le trèfle sont exploités comme productions fourragères. La famille des Légumineuses est très nombreuse (plus de 16.000 espèces), très diversifiée (comprenant des plantes herbacées annuelles et des arbres de très grande taille) et colonise des écosystèmes extrêmement variés des régions circumboréales, tempérées, désertiques et intertropicales (Dommergues et al. 1999). Les Rhizobium induisent sur les racines des légumineuses-hôtes, la formation de véritables organes, les nodosités, à l'intérieur desquelles ils fixent l'azote atmosphérique [figure 1]. Les nodosités des Légumineuses produisent chaque année, sur notre planète, davantage d’ammoniac que l’ensemble de l’industrie des engrais azotés ! Il est donc important de comprendre les mécanismes génétiques et moléculaires responsables de la formation de ces organes.
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1/ Un dialogue moléculaire entre partenaires de la symbiose : Gènes nod et facteurs Nod
On appelle Rhizobium toutes les bactéries qui sont capables d’induire la formation de nodosités chez les Légumineuses. Les Rhizobium n’appartiennent pas à un phylum unique de bactéries mais à plusieurs groupes phylogénétiques dont font également partie des bactéries non-symbiotiques [figure 2]. Cette diversité est reflétée par le fait qu’ils appartiennent à plusieurs genres (les Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium et Sinorhizobium). Les symbioses Rhizobium-Légumineuses sont très spécifiques: ainsi un Rhizobium donné n'induit la formation de nodosités fixatrices que chez un nombre défini de plantes-hôtes. Étant donnée la grande diversité observée au niveau des bactéries et des plantes, est-ce que les mécanismes responsables de l’établissement de ces symbioses sont très divers ?
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L’analyse génétique de diverses espèces de Rhizobium a permis d’identifier des gènes nod qui contrôlent la spécificité d'hôte, l'infection et la formation des nodosités. Ces gènes nod sont impliqués dans un dialogue moléculaire entre les partenaires symbiotiques [figure 3]. Les gènes régulateurs nodD, codent pour des protéines qui, en présence de signaux (de type
flavonoïdes) sécrétés par la plante, activent l’expression des autres gènes nod de la bactérie, dits gènes nod structuraux. Les gènes nodD codant pour des récepteurs spécifiques de signaux de la plante constituent un premier niveau de contrôle de la spécificité d’hôte.
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Les gènes nod structuraux sont impliqués dans la synthèse et la sécrétion de signaux symbiotiques bactériens extracellulaires, les facteurs Nod. Les facteurs Nod sont des lipo- oligosaccharides, des oligomères de chitine qui sont N-acylés par une chaîne d’acide gras (Lerouge et al. 1990). Les gènes "communs" nodABC qui sont présents chez tous les Rhizobium déterminent la synthèse de la structure de base commune à tous les facteurs Nod (Dénarié et al. 1996). Ces gènes nodABC jouent un rôle absolument essentiel dans la formation des nodosités. Une mutation dans l’un de ces gènes rend la bactérie incapable d’établir une relation symbiotique. Chaque espèce de Rhizobium présente un spectre d’hôte singulier et possède, en plus des gènes nodABC, une combinaison de gènes nod spécifiques qui "décorent" le squelette oligochitinique à l’aide de substitutions particulières qui confèrent aux facteurs Nod leur spécificité [figure 4]. Ainsi, les facteurs Nod des Sinorhizobium de luzerne sont sulfatés et acylés par un acide gras particulier tandis que les signaux des Azorhizobium de Sesbania sont substitués par deux sucres, le fucose et l’arabinose. Des expériences de génétique ont montré que les gènes contrôlant la nature et la position des substitutions sont des déterminants majeurs de la spécificité d’hôte. Les facteurs Nod ont une grande activité biologique et ils induisent à de faibles concentrations (nano à picomolaire) de nombreuses réponses symbiotiques similaires à celles induites par les bactéries elles-mêmes (Dénarié et al. 1996 ; Schultze et Kondorosi, 1998)).
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2/ Evolution des gènes nod et des facteurs Nod
Les facteurs Nod sont des clés permettant aux Rhizobium d’entrer spécifiquement dans les Légumineuses-hôtes. La diversité structurale des signaux de nodulation correspond à des variations sur un même thème et l’étude de la structure des facteurs Nod et des gènes responsables de ces variations peut fournir des indications sur les mécanismes moléculaires responsables de cette biodiversité et sur l’évolution des systèmes de communication entre symbiontes. Par exemple certains Rhizobium produisent des facteurs Nod avec une chaîne d’acide gras polyinsaturé présentant des caractéristiques différentes selon les espèces. L’aptitude à synthétiser de tels facteurs Nod n’est pas corrélée avec la phylogénie des Rhizobium mais avec celle des plantes hôtes. Ces Rhizobium nodulent des Légumineuses appartenant à un groupe bien défini, le phylum des Galégoïdes. On peut donc faire l’hypothèse qu’au cours de l’évolution est apparue, au niveau d’une branche des Légumineuses, un type de récepteur de facteur Nod permettant la reconnaissance d’une structure particulière de la chaîne d’acide gras des facteurs Nod (Yang et al. 1999).
La protéine NodA est un enzyme qui permet le transfert de l’acide gras sur l’oligomère de chitine. C’est une acyl transférase qui est spécifique des acides gras transférés et des oligomères de chitine substitués qui servent d’accepteur pour l’acide gras. L’analyse de la séquence de la protéine NodA chez les divers Rhizobium permet de prédire certaines caractéristiques structurales des facteurs Nod comme la présence de groupes fucose et arabinose, d’une chaîne d’acide gras polyinsaturé. Il existe donc une certaine corrélation entre la séquence de NodA et la spécificité d’hôte. Les gènes nod communs constituent donc de bons marqueurs moléculaires pour l’étude de la coévolution des déterminants du dialogue moléculaire.
Chez tous les Rhizobium, quelque soit le groupe auxquels ils appartiennent, il existe au moins un gène nodD, codant pour le récepteur des signaux de nodulation de la plante-hôte et des gènes nodABC. On doit donc faire l’hypothèse d’une origine unique de ces gènes clés impliqués dans les échanges de signaux de nodulation. Ces gènes auraient ensuite été transférés horizontalement entre différents groupes de bactéries du sol, conférant à celles-ci l’aptitude à noduler les Légumineuses. Des gènes nod spécifiques auraient été ensuite recrutés, formant des combinaisons variables et contribuant à la diversification des signaux (Yang et al. 1999). Les gènes symbiotiques sont regroupés chez certaines espèces sur des plasmides, facilitant le transfert "en bloc" entre souches de ces programmes génétiques. Dans d’autres espèces les gènes symbiotiques sont localisés sur le chromosome où ils forment des "îlots symbiotiques" qui peuvent être également transférés entre souches dans les sols, par des mécanismes qui n’ont pas encore été clairement identifiés.
Les gènes nod ne représentent qu’une faible partie du programme symbiotique de Rhizobium (une vingtaine de gènes parmi plusieurs centaines) et des approches plus globales sont développées pour identifier l’ensemble des gènes symbiotiques du microsymbiote. Le séquençage complet de Sinorhizobium meliloti, choisi comme Rhizobium modèle, devrait être bientôt achevé et va permettre le développement d’une génomique fonctionnelle de Rhizobium. L’utilisation de filtres à haute densité et de puces à ADN, couplée à des approches génétiques, devrait permettre d’identifier et caractériser l’ensemble des gènes de la bactérie induits au cours des différentes étapes de la symbiose.
3/ Le choix d’une Légumineuse-modèle, Medicago truncatula
Les facteurs Nod purifiés suscitent des réponses variées sur les racines de Légumineuse- hôtes, à de très faibles concentrations (nano- à picomolaires). Ils peuvent provoquer la réorganisation du cytosquelette dans les poils absorbants, ils induisent la transcription de gènes de Légumineuses, les gènes ENOD, qui sont exprimés spécifiquement au cours des étapes précoces de la symbiose, et ont un effet mitogène et organogène sur des cellules corticales (Dénarié et al. 1996 ; Schultze et kondorosi, 1998). Ainsi les Légumineuses possèdent un programme symbiotique et les facteurs Nod activent une partie de ce programme (Truchet et al., 1991). Comment identifier ce programme génétique de la plante?
La biologie moderne a montré l’utilité de concentrer les efforts de la communauté scientifique sur des organismes modèles. Dans le domaine de la biologie végétale, une petite Crucifère Arabidopsis thaliana, a fait l’objet de programmes de recherches ambitieux et le séquençage complet de son génome devrait être terminé au cours de l’année 2000. La moisson de résultats obtenus récemment sur cette plante-modèle est extrêmement abondante. Malheureusement, Arabidopsis n’est pas capable d’établir des symbioses, ni avec Rhizobium ni avec des champignons mycorhiziens. Les endomycorhizes à arbuscule sont des symbioses très importantes. Elles sont présentes chez plus de 80% des plantes et permettent une meilleure nutrition minérale, notamment phosphatée, en fournissant à la plante-hôte une forte extension du système racinaire grâce au développement d’un vaste réseau d’hyphes fongiques dans le sol (Gianinazzi 1996). Ces symbioses sont très anciennes et des fossiles suggèrent leur existence au cours de l’ère primaire (environ 400 millions d’années) : leur présence aurait alors contribué à la colonisation par les plantes du milieu terrestre. Les Légumineuses sont capables d’établir les deux types de symbioses, formation de nodosités avec des Rhizobium et formation d’endomycorhizes avec des champignons de l’ordre des Glomales.
Des équipes françaises de l’INRA et du CNRS ont identifié une Légumineuse, Medicago truncatula, qui a un génome de taille réduite, et qui présente des caractéristiques favorables
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pour les études de génétique moléculaire. Cette espèce a été adoptée, par de nombreuses équipes européennes et américaines, comme modèle pour identifier les programmes symbiotiques des végétaux.
Les facteurs Nod doivent être reconnus à la surface des poils absorbants de la plante-hôte et cette information est ensuite transduite dans différents compartiments de ces cellules et dans les cellules environnantes pour provoquer les réponses appropriées : c’est ce que l’on appelle la transduction du signal Nod (Schultze et Kondorosi, 1998). Des mutants de M. truncatula impliqués dans la transduction des signaux Nod ont été isolés. De façon surprenante, des mutants altérés dans des étapes précoces de cette cascade de transduction sont affectés à la fois pour la formation des nodosités et des endomycorhizes. L’analyse génétique révèle l’existence d’au moins trois étapes communes dans la transduction des signaux symbiotiques provenant des Rhizobium (les facteurs Nod) et des champignons mycorhiziens (d’hypothétiques facteurs Myc) [figure 5]. Le clonage des gènes de M. truncatula, contrôlant ces étapes de la transduction des signaux symbiotiques, est en cours. La découverte de la nature chimique des facteurs Nod, des oligomères de chitine, avait été surprenante. En effet, les bactéries et les plantes ne synthétisant pas de chitine, la raison pour laquelle des bactéries utilisent des oligomères de chitine pour dialoguer avec des plantes n’était pas évidente. On peut maintenant faire l’hypothèse que le programme symbiotique Rhizobium-Légumineuses, d’origine relativement récente, a emprunté certains éléments à un programme symbiotique mycorhizien plus ancien (Gianinazzi, 1996). En effet les champignons mycorhiziens synthétisent de la chitine pour élaborer la paroi de leur mycélium. Plusieurs équipes de Toulouse essaient de purifier des "facteurs Myc" pour déterminer leur nature chimique et savoir si il s’agit, ou non, d’oligomères de chitine. Il faut noter qu’en conditions de laboratoire l’addition de facteurs Nod stimule non seulement la formation de nodosités mais également la formation d’endomycorhizes. L’inoculation de Légumineuses à grande échelle (sur des dizaines de millions d’hectares) par enrobage de graines à l’aide de souches sélectionnées de Rhizobium, est pratiquée dans toutes les régions du monde et en particulier pour le soja et la luzerne aux USA, au Canada, au Brésil, en Argentine et en Europe. Des recherches de développement sont en cours, avec un partenaire industriel, pour déterminer si l’addition aux inoculum de Rhizobium de signaux symbiotiques comme les flavonoïdes et les facteurs Nod pourrait accélérer et augmenter la formation des nodules et des mycorhizes.
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4/ La génomique et l’identification des programmes symbiotiques végétaux
Les approches classiques de génétique moléculaire ont permis l’identification de gènes de Légumineuses qui sont régulés de façon particulière au cours de la formation et du
fonctionnement des nodosités, les gènes de nodulines. Les méthodes de séquençage de l’ADN à grande échelle, l’application des méthodes automatiques et des nanotechnologies à l’étude de l’hybridation des acides nucleïques et la découverte de méthodes d’amplification de l’ADN (clonage et PCR) ont permis le développement d’une discipline nouvelle, la génomique, qui vise à étudier la structure et l’expression des génomes de façon globale en identifiant non plus quelques dizaines de gènes mais l’ensemble des gènes d’un organisme, soit des milliers de gènes.
Des programmes de génomique de la légumineuse-modèle Medicago truncatula sont en cours de développement aux USA et en Europe. Les projets de génomique fonctionnelle ont notamment pour but d’identifier et de séquencer le plus grand nombre possible de gènes dont la régulation de l’expression est modifiée au cours de la formation des nodosités, de la formation des endomycorhizes et des gènes communs aux deux types de symbioses : identifier le programme génétique des endosymbioses racinaires végétales. Les projets de génomique structurale ont pour but d’établir des cartes génétiques et physiques des huit chromosomes et d’étudier la répartition des gènes, notamment symbiotiques, sur ces chromosomes. Il a été montré qu’au sein d’une même famille botanique, on observe une conservation (synténie) dans l’ordre des gènes répartis le long des chromosomes. L’existence de cette synténie justifie le développement d’une génomique comparative des Légumineuses, c’est à dire l’exploitation de la légumineuse-modèle pour faciliter la génétique et la génomique des légumineuses d’intérêt agronomique comme le soja, le pois protéagineux, l’arachide, le haricot, la féverole pour les Légumineuses à graines et la luzerne et le trèfle pour les plantes fourragères.
En effet les Légumineuses constituent la source majeure de protéines végétales tant pour l’alimentation humaine (sojas en Asie, haricots et pois) que pour l’élevage des bovins, porcins et volailles. Des incidents récents (maladie de la vache folle, etc.) ont montré que l’utilisation de sources de protéines autres que végétales dans l’alimentation animale n’était pas totalement dépourvue de risques. D’autre part, les légumineuses représentent le meilleur moyen de produire des protéines végétales dans le cadre d’une agriculture durable et respectueuse de l’environnement. En effet leur aptitude à fixer l’azote rend inutile l’utilisation d’engrais azotés. Or la synthèse, le transport et l’épandage des engrais azotés consomment des combustibles fossiles (2 tonnes de fuel pour une tonne d’ammoniac) et contribuent à l’effet de serre. Des travaux récents ont également montré que l’introduction de Légumineuses dans des rotations diminue les pertes d’azote par lessivage et la pollution des nappes phréatiques par des nitrates (Drinkwater et al. 1998). Le développement de la génomique d’une légumineuse-modèle devrait contribuer à l’amélioration génétique des légumineuses d’intérêt agronomique et au développement d’une agriculture plus amicale pour l’environnement et les consommateurs.
5/ Vers une fixation symbiotique de l’azote chez les céréales ?
Un objectif très important, pour contribuer au développement d’une agriculture durable, sera d’étendre l’aptitude à fixer l’azote à des plantes de grande culture autres que les Légumineuses, les céréales par exemple. Plusieurs stratégies sont explorées (voir Ladha et Reddy, 2000).
1) Introduire des bactéries fixatrices d’azote dans la rhizosphère des plantes. Mais dans la rhizosphère ces bactéries sont soumises à une forte compétition avec une microflore très abondante et les échanges métaboliques avec la plante-hôte sont limités. La quantité d’azote
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fixé et transféré à la plante est donc très faible (et ne dépasserait pas 5 kg d’azote par hectare).
2) Les bactéries fixatrices d’azote possèdent une vingtaine de gènes nif qui contrôlent la synthèse d’un complexe enzymatique (nitrogénase) responsable de la réduction de l’azote moléculaire en ammoniac. D’où l’idée de transférer par génie génétique des gènes nif bactériens directement dans le génome de plantes dans l’objectif de créer des plantes fixatrices d’azote. Les cibles pourraient être des organites de plantes comme les chloroplastes ou les mitochondries qui ont une origine endosymbiotique bactérienne et devraient constituer un environnement plus favorable pour l’expression de gènes bactériens. Un gène nifH a récemment été introduit dans le chloroplaste d’une algue unicellulaire Chlamydomonas et a permis la biosynthèse d’une protéine NifH fonctionnelle. Ce résultat est très encourageant, mais le projet de l’introduction de l’ensemble des gènes nif requis (une quinzaine), avec un niveau d’expression satisfaisant et compatible avec la physiologie des organites et de la plante, s’il n’est plus tout à fait de la science-fiction, reste un projet à très long terme.
3) Un autre projet à très long terme vise à transférer chez les céréales l’aptitude à former des nodosités fixatrices avec Rhizobium, en d’autres termes transférer tout ou partie du programme de nodulation des Légumineuses chez les céréales. La découverte que des gènes de Légumineuses contrôlent à la fois la formation de nodosités et d’endomycorhizes suggère que tels gènes existent chez les céréales comme le riz, le blé ou le maïs qui sont capables de former des endomycorhizes. Un projet de génomique fonctionnelle vise à identifier le programme génétique d’endomycorhization du riz. Une comparaison des programmes d’endosymbiose des Légumineuses et des céréales devrait permettre de déterminer quels sont les gènes d’endosymbiose qui existent déjà chez les céréales et ceux qui devraient être introduits à partir du génome des Légumineuses.
4) Une découverte récente réalisée par l’équipe dirigée par Paola Bonfante, à l’Université de Turin, pourrait changer les perspectives. Cette équipe a montré que certains champignons endomycorhiziens comme Gigaspora margarita contiennent des bactéries intracellulaires à l’intérieur des spores mais également dans le mycélium (Bianciotto et al. 1996). Des études d’amplification de gènes ont montré que ces bactéries appartiennent au genre Burkholderia et qu’elles possèdent des gènes nif, notamment l’opéron nifHDK présent chez toutes les bactéries fixatrices d’azote et qui code pour les deux composants de l’enzyme nitrogénase. A l’heure actuelle une collaboration entre l’équipe de Paola Bonfante, et des équipes de Toulouse et Montpellier vise à étudier l’aptitude à fixer l’azote, de ces mycorhizes. Cette découverte de bactéries nif endosymbiotiques de mycorhizes devrait ouvrir de nouvelles perspectives de recherche. En effet, le gros intérêt de la symbiose endomycorhizienne est qu’elle est présente chez la grande majorité des plantes cultivées, y compris les céréales. L’existence de certains champignons mycorhiziens possédant des bactéries endosymbiotiques fixatrices d’azote pourrait ouvrir la voie à la sélection de souches très fixatrices symbiotiques des céréales les plus importantes. Par ailleurs la génétique et la sélection des plantes cultivées et notamment des céréales devrait tenir compte de l’aptitude à établir des associations mycorhiziennes, caractère qui n’a pas été du tout pris en compte par la sélection végétale dans une phase de la recherche agronomique (la seconde moitié du 20ème siècle) fondée sur l’utilisation massive d’engrais chimiques azotés et phosphatés.
Les endosymbioses semblent avoir joué un rôle décisif dans l’évolution, en permettant l’acquisition par des cellules d’organites jouant un rôle clé dans le métabolisme énergétique. Les mitochondries sont des organites des cellules animales et végétales qui permettent la respiration cellulaire et la synthèse de l’énergie sous forme d’ATP. Elles ont très
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vraisemblablement tiré leur origine d’une association entre une cellule eucaryote primitive anaérobie et des bactéries aérobies dont l’intégration durable a permis la formation de cellules capables d’utiliser l’oxygène pour tirer leur énergie de la respiration [figure 6]. Il en est de même pour les chloroplastes, organites qui semblent avoir été acquis grâce à une endosymbiose avec des cyanobactéries photosynthétiques, et qui permettent aux végétaux de transformer de l’énergie lumineuse en énergie chimique (ATP). Il s’agit là de deux étapes considérables au cours de l’évolution qui ont modifié le fonctionnement de la biosphère et permis son extension. Au cours du 21ème siècle, l’humanité devra concilier la forte démographie de l’espèce humaine, exigeante en protéines, et la nécessité d’exploiter au mieux et de façon durable notre environnement : ce sont peut-être encore des endosymbioses qui permettront de trouver une solution. Des poupées russes d’endosymbioses : la plante hébergeant ses hôtes et leur fournissant du carbone et de l’énergie, un champignon endomycorhizien, qui a l’avantage de l’ubiquité, prospectant le sol par son mycélium étendu et améliorant la nutrition phosphatée et hydrique du système et hébergeant une bactérie endosymbiotique fixatrice d’azote.
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Les figures ont été préparées par Frédéric Debellé et Charles Rosenberg (CNRS-INRA Toulouse)
Références bibliographiques
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Drinkwater LE, Wagoner P, Sarrantonio M. (1998). Legume-based cropping systems have reduced carbon and nitrogen losses. Nature, 396, 262-265.
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Ladha JK, Reddy PM (2000) The quest for nitrogen fixation in rice. International Rice Research Institute, Makati City, 354 p.

Lerouge P, Roche P, Faucher C, Maillet F, Truchet G, Promé JC, Dénarié J (1990) Symbiotic host-specificity of Rhizobium meliloti is determined by a sulphated and acylated glucosamine oligosaccharide signal. Nature, 344: 781-784.
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Truchet G, Roche P, Lerouge P, Vasse J, Camut S, de Billy F, Promé JC, Dénarié J (1991) Sulphated lipo-oligosaccharide signals of Rhizobium meliloti elicit root nodule organogenesis in alfalfa. Nature, 351: 670-673.
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LES TECHNIQUES DES BIOTECHNOLOGIES

Texte de la 356e conférence de l’Université de tous les savoirs donnée le 21 décembre 2000.
Les nouvelles technologies en recherche biologique
Par Christophe Thurieau

Introduction

Un médicament contient une ou plusieurs molécules actives qui, administré à l’homme, provoque des modifications d’un état précédemment pathologique ou normal. Le concept de la clef et de la serrure, selon lequel un médicament actif se lie spécifiquement à une cible biologique, est ancien, et lié à Emile Fisher en 1894. Il a fallut attendre les années 60 pour que ce modèle soit enfin appliqué de façon remarquable par le pharmacologue britannique Sir James Black (devenu depuis prix Nobel). En effet, à partir de ses observations, notamment, en partant du constat que l’adrénaline, hormone surrénalienne déjà identifiée avait sur le cœur 2 catégories d’effets parfaitement distinctes, dits ? et ?, il a émis l’hypothèse que ces effets résultaient très probablement de l’action sur des récepteurs spécifiques et différents. De ces recherches, sont nés le premier ?-bloquant (anti-hypertenseur) et plus tard le premier anti-H2, la cimétidine, apport majeur au traitement des ulcères gastro-duodénaux. Dès lors une approche réellement rationnelle de la mise au point du médicament s’est établie.
Avec les progrès de la biologie cellulaire, incluant notamment la culture de lignées cellulaire et l’application du concept clef serrure, des techniques d’évaluation du niveau d’association d’un ligand avec sa cible (un récepteur ou une enzyme) dites techniques de binding (ou tests de liaison) ont pu être réalisées et permettre ainsi d’identifier des composés chimiques lorsque ceux-ci empêchent la fixation du ligand naturel.

Cependant, le point de départ de la recherche pharmaceutique a toujours été la connaissance d’un ligand (clef), qu’elle soit issue d’un produit naturel, ou qu’elle soit le résultat d’une synthèse chimique, la cible étant soit inconnue, soit identifiée tardivement dans le développement, voire après celui-ci. Aujourd’hui, les méthodes biotechnologiques permettent l’inversion de ce processus, en identifiant souvent les cibles avant même que soit connu le ligand naturel qui y est attaché. Cette approche nécessite la mise en place de concepts et d’instruments entièrement nouveaux.
En effet, les avancées scientifiques et techniques considérables de ces dernières années en biologie moléculaire, biologie cellulaire et biochimie permettent de découvrir un grand nombre de composants biologiques nouveaux dont la fonction physiologique n’est pas connue. La découverte de ces nouvelles entités biologiques génère de nouvelles cibles ou pistes potentielles de recherche.

Ces technologies innovantes, devenues progressivement disponibles depuis le début des années 90, sont en train de révolutionner les processus de découverte en biologie et en conséquence les stratégies de recherche de nouveaux médicaments.
La nouvelle stratégie de découverte des médicaments.
L’accès à ces données, l’identification de la fonction de ces acteurs bio-moléculaires fait appel aujourd’hui à un panel de technologies nouvelles résultant du mariage de techniques propres à l’informatique, la chimie, la microélectronique et de la bio-robotique.
La génomique
La génomique peut être définie comme la discipline dédiée à l’identification de l’ensemble des gènes du patrimoine génétique (le génome) et à l’élucidation de leur fonction. On parle aujourd’hui de génomique structurale (connaissance de la séquence des gènes) et de génomique fonctionnelle (analyse de la fonction). Le challenge est énorme car il s’agit de pouvoir comprendre l’organisation et la fonction de plus de 100 000 gènes et plus encore de déterminer comment les produits de ces gènes que sont les protéines interagissent pour assurer le fonctionnement d’une cellule.

Pour traiter cette augmentation exponentielle et complexe de données, des technologies révolutionnaires, les puces ADN, sont développées (Figure 1). L’étude de la dynamique de la cellule et du génome impose en effet de pouvoir analyser simultanément un mélange complexe de plusieurs dizaines de milliers de gènes dont les niveaux d’expression varient de 1 à 10 000 transcrits (ARNm) par cellule. Les puces à ADN résultent de la combinaison des techniques de miniaturisation propres à la microélectronique, de la chimie, de la biologie moléculaire et de l’informatique.
Figure 1 Les puces à ADN- Analyse de l’expression d’un grand nombre de séquences.
La puce ADN est constituée d’un réseau dense et régulier de micro surfaces, les unités d’hybridation (UH) gravées sur un support plan. Chaque UH est greffée avec des molécules simple brin d’ADN. Le rôle de chaque UH est de reconnaître, dans un mélange appliqué sur la surface de la puce, une séquence particulière, par réaction d’hybridation entre séquences complémentaires (base de la biologie moléculaire). Les molécules greffées sur la puce constituent les sondes et les ADN en solution, marqués par exemple par fluorescence, sont les cibles. A l’issue de chaque réaction d’hybridation, les signaux émis sur chaque UH sont mesurés et analysés. Le traitement des données d’intensité permet l’évaluation de la concentration des cibles cellulaires. Les plus hautes densités réalisées à ce jour sont d’environ 105 à 106 UH/cm2 (UH de 30 à 10 ?m de côté) et sont adaptées à la quantification de l’expression d’un grand nombre des gènes d’un type cellulaire donné (10 000 à 50 000 gènes exprimés). Les applications actuelles (séquençage du génome, analyse des transcrits, criblage de mutations) sont déjà révélatrices des immenses potentialités des puces ADN et de l’avenir promis à ces technologies.

Des applications futures très prometteuses verront très probablement le jour avec principalement :
- Études sur la diversité génétique humaine et l’histoire des migrations des populations.
- Recherche accélérée dans les maladies d’origine génétique ; Etudes d’association et recherche de facteurs de risques
- Analyses du spectre d’action de nouveaux médicaments (potentiel thérapeutique, effets secondaires, définition des doses, diagnostic…).
La génomique a permis l’éclosion de nouvelles disciplines dont la pharmacogénétique, étude des variations héréditaires de la réponse aux médicaments en terme d’efficacité et de toxicité. De grands programmes de pharmacogénomique sont aujourd’hui engagés, ayant pour objectif de différencier des populations d’individus répondeurs ou non répondeurs à un médicament. Cette nouvelle discipline nécessite le recours à une carte physique ultra fine du génome humain. La recherche de populations « génétiquement homogènes » est un enjeu majeur qui donnera un avantage compétitif considérable dans l’établissement d’une telle carte.
La Protéomique
Le développement des techniques de purification et d’analyses biochimiques permettent aujourd’hui d’envisager l’étude des produits des gènes que sont les protéines (Figure 2).
Figure 2 : La Protéomique- Séparation et identification des protéines cellulaires.
Il s’agit de pouvoir développer des cartographies de ces acteurs moléculaires au sein de la cellule. Les protéines contenues dans un extrait cellulaire sont séparées selon leur poids moléculaire et leur charge nette globale par électrophorèse bidimensionnelle. L’identification de ces protéines est réalisée par élution de celles-ci des gels d’électrophorèses, digestion enzymatique et analyse en spectrométrie de masse des fragments obtenus. Une comparaison des spectres obtenus avec des banques de données spectrales permet de déterminer si ces protéines sont connues.

Une image de la « population » protéique en réponse à un état cellulaire déterminé, est ainsi obtenue. Il est possible de réaliser et de comparer un grand nombre de ces cartes dans le but de repérer, et de lier une production anormale de certaines protéines à une situation pathologique.
La chimie combinatoire
Avant l’ère de la chimie combinatoire, les capacités de synthèses chimiques étaient limitées à une ou quelques molécules par semaine pour un chimiste, alors que pour obtenir un médicament candidat, il fallait disposer de plusieurs dizaines voire centaines d’analogues de la molécule active de départ.
La chimie combinatoire consiste à synthétiser en parallèle, et par des moyens très automatisés, des familles de produits ou chimiothèques (libraries), construites par assemblage de blocs de construction (building blocks pour les Anglo-saxons) ou monomères qui portent des fonctionnalités chimiques qui vont interagir avec la cible. Ces techniques permettent de générer un grand nombre de molécules et d’augmenter considérablement leur diversité.

Cette approche peut être comparée à un immense jeu de cubes, de couleurs et de tailles différentes. Chacun de ces cubes est disponible en quantité infinie et le joueur effectue, une multitude de combinaisons entre ces cubes. Parmi l'ensemble des combinaisons possibles, il retiendra la construction conforme à un objectif déterminé. Le joueur éliminera toutes les autres constructions inutiles. En prenant par exemple comme cubes des acides aminés, naturels ou artificiels, avec 20 éléments de base, les possibilités de combinaisons sont égales à 20n, n étant le nombre d'acides aminés de la construction, autrement dit, de la molécule. Pour une molécule constituée de 2 acides aminés, le nombre de possibilités d'organiser ces 20 acides aminés est de 20 x 20. Si c'est une molécule de 3 acides aminés, ce nombre passe à 20 x 20 x 20 etc.… A la différence du jeu de cubes, en laboratoire, la synthèse automatisée et systématique d'un grand nombre de molécules est réalisée en parallèle et en simultané. Les molécules ainsi construites, ainsi « synthétisées », sont toutes conservées dans des bibliothèques chimiques, ou « chimiothèques ». Chaque molécule, chaque « construction », est ensuite testée vis à vis de cibles biologiques (enzymes, hormones, récepteurs membranaires…) à l’aide de systèmes robotiques de mesure ultrarapide, appelé « criblage à haut débit ».

Le champ d’application de la chimie combinatoire s’étend d’ores et déjà au-delà du domaine des sciences de la vie. En chimie minérale, des banques combinatoire d’oxydes mixtes ont été réalisées, et ont permis de découvrir des composés magnéto résistants et supraconducteurs entièrement nouveaux.
Le criblage pharmacologique à haut rendement
Le criblage systématique de molécules d’origines diverses (chimie de synthèse, produits naturels, micro-organismes…) sur des cibles biologiques a toujours constitué une approche de choix utilisée par l’industrie pharmaceutique dans la découverte de nouveaux médicaments. De nombreux médicaments comme l’anticancéreux « Taxol », l’immunosuppresseur « Cyclosporin » ou l’antihyperlipidémiant « Sinvastatin » illustrent les succès obtenus par cette approche.
Les développements récents de la chimie combinatoire générant un nombre important de molécules avec un haut degré de diversité structurale et les progrès en robotique et en informatique scientifique, ont placé les techniques de criblage à haut rendement (HTS pour High Throughput Screening) au centre du procédé de découverte de molécules actives sur ces nouvelles cibles.

Les tests biologiques, mis au point à partir de la cible identifiée, ont ainsi évolué dans des formats permettant la mesure rapide d’activité de quelques milliers de molécules par jour au milieu des années 1990 à plusieurs dizaines de milliers par jour aujourd’hui.
Cette augmentation importante des capacités de tests est liée à une progression très rapide de la miniaturisation des technologies de détection et de prélèvement de liquide qui permettent d’assurer la manipulation avec reproductibilité de volumes de l’ordre du millionième de litre.
Figure 3 : Plate forme robotique de test biologique à haut débit
Ce criblage à haut rendement n’est possible que par la mise en place d’un laboratoire faisant appel aux derniers développements de la robotique et de l’informatique (Figure 3). L’unité de base de travail du système est une plaque de microtitration qui suivant la configuration permet le test de 96 à 1034 produits de façon simultanée.

Le protocole correspondant au test à effectuer est programmé grâce à un logiciel spécialement développé. Chaque étape de ce protocole est apprise par le système et la localisation précise et l’accessibilité des différents appareils est définie pour le bras robotique. Ces systèmes effectuent les tâches répétitives d’un test biologique comme la distribution des réactifs et des composants biologiques, les incubations, la filtration le séchage, et la lecture des résultats et assure le débit de plusieurs milliers de mesures par jour sur une cible biologique sélectionnée. Grâce à un outil informatique puissant l’analyse du flux très important d’informations provenant de ces programmes de criblage permet d’établir des corrélations rapides entre structures chimiques et activité biologiques.
Les molécules actives ainsi identifiées lors de ces premiers tests sont utilisées comme modèle pour concevoir et synthétiser de nouvelles familles de molécules plus actives et plus sélectives pour la cible biologique considérée. Cette approche itérative est effectuée jusqu’à l’obtention de composés ayant le profil d’activité recherché. L’objectif est d’identifier rapidement un candidat médicament qui pourra être testé sur des espèces animales et éventuellement lors d’essais cliniques chez l’homme.

Les technologies de test à haut débit sont en pleine évolution et aujourd’hui elles s’étendent à des domaines de complexité croissante. En effet, l’objectif est de pouvoir réaliser des mesures d’activités d’une même molécule sur différents paramètres cellulaires avec la même rapidité et reproductibilité que sur des composants biologiques isolés comme les récepteurs et les enzymes. Ces techniques sont basées sur de l’application des marqueurs de fluorescences dans les tests biologiques et sur le développement d’algorithmes de traitement d’image. En réponse à des stimuli particuliers plusieurs mécanismes intracellulaires peuvent être analysés comme l’internalisation de récepteurs, le trafic intracellulaire, l’activation de certains gènes et bien sur la viabilité et la motilité cellulaire.

Conclusion
Les informations provenant des programmes de séquençage du génome humain nous permettent de prédire que celui ci est composé de 100 000 à 120 000 gènes. L’identification de la structure et de la fonction de ces gènes représente un challenge sans précédent. De l’étude de leur structure et de leur fonction pourront naître 5 000 à 10 000 nouvelles cibles biologiques potentielles pour le développement de futurs agents thérapeutiques. C’est pour pouvoir relever ce défi, que les laboratoires de recherche s’emploient à développer et à mettre en place un grand nombre de technologies innovantes.

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BIOLOGIE  MOLÉCULAIRE

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